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脂肪酶制劑 - 脂肪酶制劑的酶活力和動態滴定法測定脂肪酶的酶活力
來源: KEM China   發布時間: 2021-03-06 08:23   172 次瀏覽   大小:  16px  14px  12px
GB/T 23535-2009 脂肪酶制劑 - 脂肪酶制劑的酶活力和動態滴定法測定脂肪酶的酶活力


GB/T 23535-2009 脂肪酶制劑

范圍
本標準規定了脂肪酶制劑的術語和定義、產品分類、要求、試驗方法、檢驗規則和標志、包裝、運輸、貯存。
本標準適用于以淀粉質(或糖質)為原料,經微生物發酵、提純制得的中性脂肪酶制劑的生產、檢驗和銷售。

術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
脂肪酶? lipase
能水解甘油三酯或脂肪酸酯產生單或雙甘油酯和游離脂肪酸,將天然油脂水解為脂肪酸及甘油,同時也能催化酯合成和酯交換反應的酶。
脂肪酶活力? activity of lipase
脂肪酶活力以脂肪酶活力單位表示,定義為1g固體酶粉(或1mL液體酶),在一定溫度和pH條件下,1min水解底物產生1μmol的可滴定的脂肪酸,即為1個酶活力單位,以u/g(u/mL)表示。

產品分類
按產品的應用領域
A類產品一一食品工業和飼料工業用酶制劑。
B類產品一一其他工業用酶制劑。
按產品形態
固體劑型酶制劑和液體劑型酶制劑。

要求
外觀
固體劑型: 白色至黃褐色粉末或顆粒,無結塊、無潮解現象。無異味。有特殊發酵氣味。
液體劑型: 淺黃色至棕褐色液體,允許有少量凝聚物。無異味。有特殊發酵氣味。
理化要求
應符合表1的規定。


衛生要求
應符合國家有關規定。

試驗方法
酶活力
原理
脂肪酶在一定條件下,能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油,所釋放的脂肪酸可用標準堿溶液進行中和滴定,用pH計或酚酞指示液指示反應終點,根據消耗的堿量,計算其酶活力。
反應式為:

注1: 酯酶的存在會使檢測的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在會降解脂肪酶,從而使檢測到的脂肪酶的活力減小。
注2: 洗滌劑的存在會嚴重影響本方法。依不同洗滌劑的類型和濃度不同,這種影響表現為從完全抑制到激活。
注3: 酶會附著在塑料上,因此應用玻璃器皿溶解稀釋,同時也應用玻璃器皿滴定。在溶液的轉移中如果時間很短,且選擇適當的塑料材質,可以使用塑料移液槍頭。

分析步驟
待測酶液的制備
一一稱取酶樣品1g~2g,精確至0.0002g,用磷酸緩沖液溶解并稀釋。如果樣品為粉狀,可用少量磷酸緩沖液溶解后用玻璃棒搗研,然后將上清液小心傾入容量瓶中。若有剩余殘渣,再加少量磷酸緩沖液充分研磨,最終樣品全部移入容量瓶中,用磷酸緩沖液定容至刻度,搖勻,轉入高速勻漿機組織搗碎機搗研3min后供測定。
一一測定時控制酶液濃度,樣品與對照消耗堿量之差控制在1mL~2mL范圍內。
吸取樣品時,應將酶液搖勻后再取。

測定
電位滴定法(第一法)
a) 按pH計使用說明書進行儀器校正;
b) 取兩個100mL燒杯,于空白杯(A)和樣品杯(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸緩沖液5.00mL,再于A杯中加入95%乙醇15.00mL,于40°C±0.2°C水浴中預熱5min,然后于A、B杯中各加待測酶液1.00mL,立即混勻計時,準確反應15min后,于B杯中立即補加95%乙醇15.00mL終止反應,取出;
c) 在燒杯中加入一枚轉子,置于電磁攪拌器上,邊攪拌,邊用氫氧化鈉標準溶液滴定,直至pH10.3,為滴定終點,記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積。
指示劑滴定法(第二法)
a) 取兩個100mL三角瓶,分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸緩沖液5.00mL,再于A瓶中加入95%乙醇15.00mL,于40°C±0.2°C水浴中預熱5min,然后于A、B瓶中各加待測酶液1.00mL,立即混勻計時,準確反應15min后,于B瓶中立即補加95%乙醇15.0mL終止反應,取出;
b) 于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液兩滴,用氫氧化鈉標準溶液滴定,直至微紅色并保持30s不褪色為滴定終點,記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積。

計算
脂肪酶制劑的酶活力按式(1)計算:

式中:
X1一一樣品的酶活力,u/g;
V1一一滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,單位為毫升(mL);
V2一一滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,單位為毫升(mL);
c??一一氫氧化鈉標準溶液濃度,單位為摩爾每升(mol/L);
50一一0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00mL相當于脂肪酸50μmol;
n1一一樣品的稀釋倍數;
0.05一一氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數;
1/15一一反應時間15min,以1min計。
所得結果表示至整數。
精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的2%。

附錄A? (資料性附錄)
動態滴定法測定脂肪酶的酶活力

范圍
本方法適用于測定含有或混有脂肪酶/酯酶樣品中的脂肪酶活力。
特殊的脂肪酶或特殊的成品制劑在樣品制備階段需采用特殊的穩定或抽提手段以保證檢測到所有的脂肪酶活力。

原理
脂肪酶水解甘油三酯生成脂肪酸,使反應體系的pH不斷下降。通過連續加入堿的方法保持反應體系的pH恒定。堿滴定的速率與酶活力成比例。
注1: 酯酶的存在會使檢測的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在會降解脂肪酶,從而使檢測到的脂肪酶的活力減小。
注2: 洗滌劑的存在會嚴重影響本方法。依不同洗滌劑的類型和濃度不同,這種影響表現為從完全抑制到激活。
注3: 酶會附著在塑料上,因此應用玻璃器皿溶解稀釋,同時也應用玻璃器皿滴定。在溶液的轉移中如果時間很短,且選擇適當的塑料材質,可以使用塑料移液槍頭。
反應式

反應條件
溫度: 30°C±1°C。
pH: 7.00。
底物濃度: 0.16mol/L的三丁酸甘油酯。
反應時間: 至少1.5min(只有線性反應區用于計算斜率)。
分析范圍
樣品的分析范圍是0.2u/mL~4.0u/mL。如果可能,所有樣品應在1.5u/mL~4.0u/mL的范圍內被分析。
檢測限
對于液體樣品檢測限為20u/g,相當于2.5g樣品溶解在10mL溶液中,然后再稀釋25倍。對于固體樣品檢測限為50u/g,相當于1.0g樣品溶解在10mL溶液中,然后再稀釋25倍。

儀器和設備
具有動態滴定(pH-stat)功能的滴定儀。在動態滴定儀中還要注意選擇適當的pH電極(對pH值響應快)和滴定分配樣品準確(特別是滴定氫氧化鈉)。還要選擇玻璃滴定容器(帶水浴夾套)和有效的攪拌器(棒狀螺旋攪拌器優于磁力攪拌),這樣才構成完整的系統。
乳化器。
恒溫水浴: 精度±0.2°C。
溫度計: 精度±0.2°C。
自動移液器。

試劑
除非另有說明,在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。
三丁酸甘油酶(C15H26O6)。
氯化鈉(NaCl)。
磷酸二氫鉀(KH2PO4)。
阿拉伯膠。
甘氨酸(H2NCH2COOH)。
甘油[HOCH2CH(OH)CH2OH]。
氫氧化鈉片劑(NaOH)。
電極校正液(pH7.0)。
電極校正液(pH4.01)。
96%乙醇。
氮氣(N2)。
氫氧化鈉溶液[c(NaOH)=1mol/L]: 按照 GB/T 601 配制。
氫氧化鈉滴定液[c(NaOH)=0.025mol/L]: 取上述溶液25mL,用水稀釋并定容到1000mL。
配好后需用適宜的設備脫氣。
氫氧化鈉滴定液[c(NaOH)=0.005mol/L]: 取氫氧化鈉滴定液25mL,用水稀釋并定容到5000mL。
乳化劑: 分別稱取阿拉伯膠30.0g、氯化鈉53.7g和磷酸二氫鉀1.20g。量取甘油1620mL 。
將大約180mL去離子水倒入400mL的燒杯中,加入攪拌子,開始高速攪拌,將阿拉伯膠緩慢倒入水中,不斷攪拌直至全部溶解。將稱好的氯化鈉和磷酸二氫鉀轉入到3L容量瓶中,加350mL水充分攪拌直至完全溶解,將甘油全部加入。將阿拉伯膠溶液轉入容量瓶中,充分攪拌后用水定容。
底物乳劑: 稱取三丁酸甘油酯62.5g,分別量取乳化劑200mL和水940mL,混合。將混合液勻漿器處理3min(7000r/min)。勻漿后的溶液先用普通的磁力攪拌攪拌至少20min,然后調節pH到4.75±0.05。
不同來源和批號的三丁酸甘油酯和阿拉伯膠對試驗結果有影響,在更換產品或批號前需進行有效性確認。
甘氨酸緩沖液1(7.51g/L): 稱取甘氨酸37.54g和氫氧化鈉片劑18.5g,用水溶解并定容到5L。如需要,調節溶液的pH到10.8±0.05。
甘氨酸緩沖液2(0.75g/L): 取100mL上述甘氨酸緩沖液1,用水定容到1000mL。如需要,調節溶液的pH到10.8±0.05。

標準曲線和樣品處理
標準曲線
稱取一定量的已知活力酶標準品,精確到0.0001g。然后用甘氨酸緩沖液2溶解并稀釋,制成標準儲備液。標準儲備液的濃度為20u/mL。然后按照表A.1配制溶液,并繪制標準曲線。


標準對照
可使用已知活力的樣品作為標準對照。標準對照的處理同樣品。
樣品處理
不同的樣品需做不同的預處理,以激活或保護在樣品基質中的脂肪酶。
可考慮采用甘氨酸緩沖液1和水來分別溶解和稀釋樣品的方法,或甘氨酸緩沖液2來溶解和稀釋樣品的方法,或直接用水溶解和稀釋樣品的方法,以求得到最好的效果。樣品的溶解液和稀釋液應充分攪拌均勻。
樣品應最終稀釋到酶活力在1.5u/mL~4.0u/mL范圍內。
如可能,樣品稀釋完應立即測定。

分析步驟
系統準備
按照無水乙醇、適當的肥皂水、熱水、去離子水、底物的順序清洗滴定容器和管路。
保證水浴的溫度在30.0°C±0.5°C。
校正pH電極: 每天使用前要校正pH電極的靈敏度在95%~102%;pH7.00應在6.985~6.989之間;pH4.01應在4.009~4.012之間。如果達不到此標準,按照pH電極使用說明進行沖洗并再次校正。
分析
pH電極用后浸泡在飽和的氯化鉀(KCl)溶液中,使用前沖洗。
在反應溶液表面用氮氣吹充,以防止空氣中二氧化碳的干擾。分析前一定要保證底物的溫度為30.0°C±0.5°C。
在分析每個樣品前要用0.005mol/L的氫氧化鈉溶液沖洗滴定皿和管路。
試驗步驟如下:
一一將15mL的底物加入到滴定皿中。滴定前pH電極的讀數應小于7.0。
一一加1mL樣品稀釋液加入到滴定皿中。反應體系的pH在滴定過程中保持在7.0。記錄為保持恒定pH而加入的滴定液的量。
一一滴定結束后滴定儀打印出滴定曲線線性范圍的平均斜率(如果使用不同的設備,數據可能以其他形式輸出)。滴定曲線應有一段持續1.5min的線性輸出。
一一先分析標準曲線(每個標準點分析1次),然后分析一個標準對照,再分析樣品(每個樣品分析1次)。重要的是一天之中非一次運行的樣品不能使用相同的標準曲線。事先應知道每一次運行的樣品的個數。如果樣品在當天晚些時候分析,標準溶液要重新分析。
一一每個樣品分析前和最后一個樣品完成分析后,系統將進行沖洗。排空底物容器和管路,并用乙醇沖洗。如果系統將會在1周以上時間不再使用,則需要用去離子水進行沖洗并用氫氧化鈉溶液或相同濃度的鹽酸溶液充滿敏感部件,避免出現鹽類結晶。

計算
結果計算
利用標準點的測定值作標準曲線,其中X 軸為標準品酶活力, Y 軸為相應的滴定反應的平均斜率(mL/min)。標準曲線應該是一條直線。樣品稀釋液的活力從標準曲線中讀出,然后按式(A.1)計算:

式中:
X3一一樣品的酶活力,u/g;
A 一一稀釋樣品在標準曲線上讀出的酶活力,u/mL;
V3一一樣品溶解用的容量瓶體積,單位為毫升(mL);
n2一一第二次稀釋的倍數;
m3一一樣品的質量,單位為克(g)。
結果的確認
當滿足以下條件時可以確認本次分析有效:
一一標準對照的檢測值在本方法所規定的可接受偏差范圍內;
一一標準曲線的斜率應滿足: 1) 標準點1小于0.02mL/min;2) 標準點6在0.14mL/min~0.18mL/min之間;
一一標準曲線的相關系數(r2)大于等于0.995;
一一標準點~點6的相關系數的應大于0.9995。標準點1~2的r2大于0.995是可接受的。
如果達不到此條件,應檢查分析系統。
結果的表示
結果給出3位有效數字。如果結果低于檢測限,則表示為<20u/g(液體)或<50u/g(固體)。
精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的5%。


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